本文作者:物华草木

山茱萸多糖的提取及含量测定山茱萸

物华草木 6个月前 ( 10-25 ) 5473 抢沙发
山茱萸多糖的提取及含量测定山茱萸摘要: 目的提取山茱萸多糖,建立山茱萸多糖的含量测定方法。方法采用均匀设计法优化山茱萸多糖的提取条件。采用热水提取、乙醇沉淀和DE-52柱层析对多糖进行提取纯化,并用苯酚-硫酸比色...

山茱萸多糖的提取及含量测定山茱萸

目的提取山茱萸多糖,建立山茱萸多糖的含量测定方法。方法采用均匀设计法优化山茱萸多糖的提取条件。采用热水提取、乙醇沉淀和DE-52柱层析对多糖进行提取纯化,并用苯酚-硫酸比色法测定多糖含量。结果山茱萸多糖含量为16.04%,平均回收率为99.01%,相对标准偏差为1.13%(n=3)。结论首次采用均匀设计优化山茱萸多糖的提取条件,提取率高。苯酚-硫酸比色法稳定,回收率好。

extractionand determinationonfothecontentofpolysiodidefromposicorni

摘要:目的从果糖中提取多糖,建立测定多糖含量的方法。方法利用MethodsUniformdesigntestwas从苹果中提取多糖。多糖提取、乙醇沉淀、DE-52色谱。苯酚-硫酸比色法测定多糖含量。结果多糖含量为16.04%,平均回收率为99.01%,回收率为1.13%(n=3)。苯酚-硫酸比色法是一种稳定的生产纤维素的方法。

关键词:果聚糖;多糖;Uniformdesign抽出

山茱萸[1]是山茱萸的干果肉。又称山茱萸、酸枣等。在临床医学中,它是一种去籽的中药。味酸、涩、温,属肝肾经。具有补肝肾、涩固之功效。中医临床研究证明,山茱萸是治疗糖尿病、冠心病、高血压的主要药物。果肉中的主要成分是糖类、有机酸及其酯类、单宁等。多糖是生命代谢中不可缺少的重要物质,具有多种生物活性,已成为生物医学研究和开发的热点。本文以山茱萸为原料,通过均匀设计实验[4]优化山茱萸多糖的提取条件,并通过乙醇沉淀和DE-52柱层析进一步纯化,采用苯酚-硫酸比色法测定山茱萸多糖的含量。

1台设备

1.1材料山茱萸干果(产地:河南西峡县,药店购)。

1.2试剂D()-葡萄糖(上海华硕精细化工有限公司Fluka进口);再蒸馏苯酚(北京双香达生化试剂);DE-52(进口包装,whatman产品,国药化学试剂有限公司);其他试剂在国内都是分析纯。

1.3仪器TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京通用仪器有限公司);台式离心机(太仓医疗器械厂);数显恒温水浴锅HH-6(国华电器有限公司);中兴高速万能破碎机(中兴叶巍有限公司);旋转式蒸发器RE-52AA(上海亚荣生化仪器厂);色谱装置(上海沪西分析仪器厂)。

2方法和结果

2.1山茱萸多糖的提取和纯化

2.1.1山茱萸多糖的提取纯化工艺:山茱萸干果粉碎过100目筛山茱萸粉用95%乙醇回流8h脱脂冷却抽滤干燥滤渣预处理山茱萸粉水提离心上清液合并上清液浓缩乙醇沉淀干燥得到粗多糖。将粗多糖溶于水中,透析,用DE-52柱层析纯化,收集部分多糖洗脱液,浓缩,乙醇沉淀,冷冻干燥,得到白山茱萸多糖。

2.1.2山茱萸多糖提取条件的均匀设计实验优化选择提取温度、提取时间和固液比三个因素,以山茱萸多糖提取得率为考察指标,进行三因素八水平的均匀设计实验,如表1所示。称取一定量预处理后的山茱萸粉,用不同料液比、提取温度和提取时间的恒温水浴浸泡,以4000转/分钟离心15分钟,合并上清液,加入3倍体积的95%乙醇,4离心24小时,得到粗多糖,将其溶于热水中,定容,用苯酚-硫酸法测定多糖含量,计算多糖得率。结果如表1所示。

多糖得率(mg/g)=(CDVf)/W,其中c为多糖溶液中葡萄糖的浓度(mg/ml)。d为多糖溶液的稀释倍数,v为多糖溶液的体积(ml),f为山茱萸多糖的转化因子,w为预处理后山茱萸粉的质量(g)。利用王玉芳均匀设计软件2.10,采用回归方法(显著性水平=0.05),对实验结果进行回归分析,回归方程3360 y=b (0) b (1) * x(提出b(1)=33.01 e-2;b(2)=1.37;b(3)=2.86;即回归方程为y=-98 . 733 . 01 e-2 * x(1)1.37 * x(2)2.86 * x(3)。采用网格试验法对实验条件进行优化,优化后的实验条件为:最佳提取温度为100,提取时间为180分钟,料液比为136,预期指标最大

2.1.3验证实验为了验证优化结果的可靠性,我们选择X1=100,X1=100分钟,X3=1:36进行验证实验,并行运行3份。平均收率为199.36毫克/克,接近预测值。这种统一的设计是有意义的。

2.1.4山茱萸多糖的纯化将少量粗多糖溶于蒸馏水中,离心,上清液用DE-52柱层析纯化,用250ml浓度为0 ~ 1 mol/l的氯化钠溶液梯度洗脱,流速为2ml/min,收集不同部位的洗脱液,每管收集10ml,用苯酚-硫酸法跟踪检测,绘制洗脱曲线。结果如图1所示。合并单个主峰部分(12 ~ 25管),透析,浓缩,乙醇沉淀,冷冻干燥,得到白山茱萸多糖。

2.2山茱萸多糖含量的测定

2.2.1最大吸收波长的选择配制不同浓度的葡萄糖标准溶液和山茱萸多糖溶液,用苯酚-硫酸法显色,在400~600nm波长范围内扫描,吸收光谱相近,最大光吸收在489nm,因此测定波长为489nm。

2.2.2绘制标准曲线准确称取100毫克干燥至恒重的葡萄糖,放入100毫升容量瓶中,加水溶解稀释至刻度,摇匀,得到1毫克/毫升葡萄糖溶液和0.10毫克/毫升葡萄糖标准溶液。将0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和0.7毫升葡萄糖标准溶液(浓度:0.10毫克/毫升)准确吸入试管,加入蒸馏水至1毫升,加入1毫升5%苯酚(避光保存在冰箱中),混合均匀,迅速加入5毫升浓硫酸,混合均匀,室温下,在489纳米测量吸光度。画一条吸收值为纵坐标,浓度为横坐标的标准曲线。结果如图2所示。线性范围为10~70g/ml。回归方程C=0.00054A 0.09328相关系数r=0.99984。

2.2.3转化系数的测定准确称取35毫克山茱萸多糖,放入100毫升容量瓶中,用热水溶解至定容,准确吸收0.1毫升,用苯酚-硫酸法测定其吸收值,用回归方程计算多糖中葡萄糖的浓度。根据公式,换算系数计算如下:f=W/CD,其中W为山茱萸多糖的质量(mg),c为多糖溶液中葡萄糖的浓度(mg/ml),d为多糖溶液的稀释系数,测得的f为f=4.2。

2.2.4稳定性试验准确吸收适量样品溶液,并按“2.2.2”方法测定吸光度值,每30分钟一次,并连续检测

2.2.5样品测定:分别准确称量2.00 g、2.02 g、2.07 g和2.06g粉碎的山茱萸粉,用8倍体积的95%乙醇回流8小时,离心去除上清液。向沉淀物中加入一定体积的蒸馏水,溶液在100下反复回流提取。将提取液固定在250毫升容量瓶中,并均匀摇匀成为样品溶液。在测定中,准确吸收适量的样品溶液,用与标准曲线相同的方法测定其吸收值,以葡萄糖为标准,根据回归方程计算样品中的葡萄糖浓度,根据以下公式计算样品中的多糖含量:多糖含量(%)=(CDVf/W)100,其中c为样品溶液中的葡萄糖浓度(mg/ml)。d为样品溶液的稀释倍数,F为换算系数,V为多糖体积(ml),W为样品质量(mg),平均结果为16.04%,RSD=1.03%(n=4)。

2.2.6回收率实验准确称取5份1.0g山茱萸粉,准确加入适量山茱萸多糖,按“2.2.5”进行分析。平均回收率为99.01%,相对标准偏差为1.5%。

3结论

在多糖提取过程中,利用单糖和多糖在95%乙醇中的溶解度差异,乙醇回流可以有效去除原料预处理时的单糖,乙醇沉淀可以有效分离和浓缩多糖。通过均匀设计实验优化山茱萸多糖的提取条件。最佳提取条件为:料液比136,提取温度100,提取时间180分钟。山茱萸多糖得率可达199.36毫克/克(相对于预处理后的山茱萸粉)。苯酚-硫酸法测定山茱萸中多糖的含量为16.04%,多糖的转化系数为4.2。山茱萸多糖提取和含量测定方法的建立,为今后山茱萸多糖的大规模提取和生物活性分析奠定了基础。

参考文献:

[1]方嘉轩、梁。南阳中草药经典[M]。南阳:三秦出版社,2004: 454。

周京华,李春生,李殿东。引用该论文王志平,王志平,王志平.中国新药杂志,2001,10 (11) :808。

杨云,刘建新,刘翠萍,等。山茱萸多糖的化学研究[J]。中华中医杂志,1999,24 (10) :614。

方开泰。均匀设计与均匀设计表[M]。北京:科学出版社,1994。

张伟杰。糖复合体生化研究技术,第2版[M]。杭州:浙江大学出版社,1999: 11。

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